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Ultra-Universal One Step Seamless Cloning Mix
通用型一步法無縫克隆試劑盒
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CW3036M
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- 產(chǎn)品介紹
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- FAQs
本產(chǎn)品是基于同源重組原理開發(fā)的一款簡單、快速、高效的無縫克隆試劑盒，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，可將DNA片段定向克隆至任意載體的任意位點，不受酶切位點限制，可以高效兼容1-5個片段同源重組。2×Ultra Cloning MasterMix中添加了獨特的輔助因子及穩(wěn)定劑，有效提高重組效率，50℃反應(yīng)5-30min即可進行連接，陽性率達95%以上。經(jīng)過優(yōu)化的反應(yīng)Buffer體系，兼容性更強，提高了復(fù)雜體系的克隆成功率。
圖a：單片段無縫連接示意圖 ? ? ? ? ? 圖b：多片段無縫連接示意圖
? 快速高效：1-3個片段的連接僅需5-15 min，超過3個片段的連接可以延長至30 min，克隆陽性率高達95%以上。
? 操作簡便：不受酶切位點的限制，可在任意位點進行克?；受?粘末端的限制。
? 無縫連接：插入點不會引入不需要的堿基序列。
? 應(yīng)用廣泛：高效克隆50 bp-10 kb片段；也可結(jié)合Super pfx高保真酶，應(yīng)用于定點突變。
如下實驗均使用CW3036進行重組反應(yīng)，CW0808感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，CW3339 PCR mix進行菌落PCR。
1.兼容單片段和多片段連接，陽性率高
【實驗一】使用CW3036，分別連接5 kb載體和1個，2個，3個不同插入片段，均能獲得很好的克隆效果，長斑情況良好，陽性率高達100%。
圖1：不同插入片段數(shù)量克隆效果
2.長片段克隆效果好
【實驗二】分別使用A公司同類產(chǎn)品和CW3036連接5 kb載體和12 kb插入片段，使用CW3036長斑更多，陽性率100%。
圖2：與同類產(chǎn)品長片段克隆效果對比
3. 穩(wěn)定性好
【實驗三】將CW3036在室溫或37℃放置7天進行熱穩(wěn)定性測試，以及將其反復(fù)凍融30次進行凍融穩(wěn)定性測試，與對照組相比，克隆效果不變。
圖3.1：熱穩(wěn)定性測試
圖3.2：凍融穩(wěn)定性測試
| 保存條件 | 運輸條件 |
|---|---|
| -20℃ | 冰袋 |
（1）具體計算方法請參考說明書，若計算得到的用量超過最低/最高值，則建議直接按最低/最高用量使用；
（2） 若載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多，克隆陽性率均會降低；
（3） 若某一組分濃度過高可適當(dāng)稀釋后使用，每個組分的用量最好不低于1 μL
（4）當(dāng)插入片段擴增模板是與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時，推薦加入陰性對照（只加片段）；
陽性率和菌落數(shù)相關(guān)，菌落數(shù)一定程度上說明了陽性率，如果客戶沒有菌落數(shù)量要求，在平板上能夠挑到陽性即可，是可以調(diào)低模板，對于大片段需要投入80-200ng，小片段可放低至20-60ng，具體還需要客戶自行調(diào)整。
連接片段不要小于200bp，最好在500bp 及以上；最大測試過12k，能夠連接且陽率正確。
有要求，合成引物時GC 含量盡量在40-60 之間以確保后續(xù)連接效率。
如果黏性末端形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)，那么成功率會大受影響。
