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GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit (Plus)
金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（加強(qiáng)型）
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本產(chǎn)品每次可處理100-300 mL菌液，所得質(zhì)粒純度高、得率高，可獲得多至2 mg轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒DNA。采用特殊的去內(nèi)毒素Buffer ER1和Endo-Remover FQ，可有效的去除內(nèi)毒素、 蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。產(chǎn)品內(nèi)另配備特殊指示劑CWBlue，保障質(zhì)粒提取高效完成。
? 操作準(zhǔn)確：加入顏色指示劑，保證操作的準(zhǔn)確性，得到純度高、質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒。
? 提取得率高：適用于100-300mL菌液，得率大于2mg。
? 無(wú)內(nèi)毒素：采用除內(nèi)毒素過(guò)濾器和去內(nèi)毒素Buffer ER，高效去除內(nèi)毒素，可獲得轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒。
? 適用范圍廣：適用于各種大小和高低拷貝數(shù)的目的質(zhì)粒。
1. 適用于高拷貝/低拷貝質(zhì)粒提取
【實(shí)驗(yàn)一】使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒分別提取高拷貝（p13）及低拷貝（pET-26b）質(zhì)粒，洗脫體積2mL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣5μL，結(jié)果如下所示：
圖1：高拷貝質(zhì)粒（左圖）及低拷貝質(zhì)粒（右圖）提取結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒應(yīng)用范圍廣，適用于高拷貝/低拷貝質(zhì)粒提取。
2. 質(zhì)粒得率更高
【實(shí)驗(yàn)二】使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒與A/B品牌分別進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如下：
M：DM10000 ; Lane1、2: 金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 (CW2113) ; Lane3、4: A品牌無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒
圖2：使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(CW2113)和A品牌無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取結(jié)果。
M:DM10000 ; Lane1、2、3:B品牌無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 ; Lane4、5、6:QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(CW2113)
圖3：使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(CW2113)和B品牌無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒得率更高。
3. 去除內(nèi)毒素，轉(zhuǎn)染更高效
【實(shí)驗(yàn)三】使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和Hela細(xì)胞，結(jié)果如下：
圖4：使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(CW2113)提取的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞（左圖）和Hela細(xì)胞(右圖)后效果圖。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用QY千億國(guó)際世紀(jì)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(CW2113)提取質(zhì)粒，去內(nèi)毒素效果好，轉(zhuǎn)染效率高。
| 保存條件 | 運(yùn)輸條件 |
|---|---|
| RT（15-30℃） | 室溫 |
若所提質(zhì)？獎(jiǎng)詞系突虼笥10 kb的大質(zhì)粒，可加大菌體使用量，同時(shí)按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer E3的用量保證菌體可以被完全裂解，洗脫緩沖液Endo-Free Buffer EB應(yīng)在65℃-70 ℃水浴鍋預(yù)熱，同時(shí)在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。
（1）質(zhì)？獎(jiǎng)詞：載體因拷貝數(shù)差異會(huì)造成質(zhì)粒產(chǎn)量明顯的波動(dòng)。高拷貝數(shù)的載體常有2-3倍的產(chǎn)量波動(dòng)，（每毫升培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體產(chǎn)量為3-16 μg）。長(zhǎng)片段質(zhì)：捅澩鐨馱靨宄Ｒ災(zāi)械涂獎(jiǎng)詞，每毫升菌液的產(chǎn)量約為0.5~2 μg；
◇低拷貝質(zhì)粒：pBR322, pACYC 及其衍生載體，pSC101 及其衍生載體，SuperCos, pWE15；
◇高拷貝質(zhì)粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；
（2）菌種問(wèn)題：菌種保存過(guò)程中存在質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)菌前最好先劃線(xiàn)活化，以穩(wěn)定產(chǎn)量；
（3） 細(xì)菌未充分裂解：細(xì)菌須在Buffer P1/RNase A 中充分重懸，成團(tuán)的細(xì)菌因無(wú)法裂解會(huì)降低產(chǎn)量；
（4） 試劑準(zhǔn)備有誤：Buffer P2、Buffer E3有沉淀析出，需37℃水浴幾分鐘至清亮方可使用；Buffer PW加入乙醇體積不準(zhǔn)確（使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在Buffer PW中加入無(wú)水乙醇）；
（5）將Endo-Free Buffer EB預(yù)熱至65℃-70 ℃，并重復(fù)二次洗脫；
（6）培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或在 2-8℃保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)明顯降低產(chǎn)量，建議使用新鮮的菌液。
37℃水浴混勻至澄清后使用。
加入Buffer P2后應(yīng)溫和混勻，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA。此
步驟所用時(shí)間應(yīng)不超過(guò)5分鐘，避免質(zhì)粒受到破壞。
導(dǎo)致RNA污染，需補(bǔ)加RNase A至Buffer P1（終濃度160 μg/mL），混勻后2-8℃保存。
乙醇?xì)埩?。Buffer PW 洗滌后應(yīng)盡量離心去除殘留的液體，待硅膠膜完全干燥后再加入洗脫緩沖液。
不可以，因?yàn)榻湍甘钦婢?，細(xì)胞壁比大腸桿菌（細(xì)菌）的更厚，因此使用CW2113M更難裂解，建議使用Yeast Plasmid Mini Kit（CW0509S ）提取。
可以。最好按照標(biāo)準(zhǔn)存放。
（1）儲(chǔ)存溫度不當(dāng)或超出有效期：已加入RNase A的Buffer P1長(zhǎng)時(shí)間室溫放置可能會(huì)出現(xiàn)酶活下降，使用后應(yīng)及時(shí)放回2 ~ 8℃。
（2）菌液體積過(guò)高：由于菌體數(shù)量過(guò)多，導(dǎo)致Buffer P1中RNase A不足以消化菌體中的RNA，建議減少菌液體積進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
可以，該試劑盒提取的質(zhì)粒純度滿(mǎn)足測(cè)序、PCR、酶切和轉(zhuǎn)染等需求。
可以使用無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的核酸酶游離水（pH 7.0-8.5）從離心柱中洗脫DNA，以獲得最佳洗脫效率。如需長(zhǎng)期保存DNA，推薦使用試劑盒配套的DNA洗脫緩沖液。
在質(zhì)粒條帶上方出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象可能表明質(zhì)粒提取物中存在基因組DNA污染。雖然這種情況并不常見(jiàn)，但基因組DNA可能在裂解過(guò)程中被剪切并與質(zhì)粒共同純化。加入Buffer P2后劇烈搖晃或渦旋可能會(huì)產(chǎn)生斷裂的基因組DNA，應(yīng)避免這種情況。如果裂解液非常粘稠且混合不均勻，建議減少實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞起始量。
A260/280比值通過(guò)比較核酸最大吸收峰260nm與蛋白質(zhì)最大吸收峰280nm的吸光度值，可評(píng)估所洗脫DNA的相對(duì)純度。若中和反應(yīng)不充分或洗滌步驟不完全，可能導(dǎo)致過(guò)量蛋白質(zhì)殘留在基質(zhì)中并與DNA共同洗脫。
培養(yǎng)基成分和某些細(xì)胞成分會(huì)降低A260/A230比值。按照實(shí)驗(yàn)方案操作可確保去除這些污染物。此外，某些顆粒物可能與DNA一起洗脫，從而影響該比值。若出現(xiàn)這種情況，可在分光光度計(jì)（如Nanodrop®）檢測(cè)前對(duì)洗脫的DNA進(jìn)行額外15秒離心以沉淀顆粒物。
雖然Endo-Remover FQ和Buffer ER能去除樣品中絕大部分內(nèi)毒素，但無(wú)法保證回收的DNA完全不含內(nèi)毒素。需要說(shuō)明的是，QY千億國(guó)際已成功使用該試劑盒回收的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染多種耐受性強(qiáng)的細(xì)胞系。盡管其他供應(yīng)商可能宣稱(chēng)其小提試劑盒"無(wú)內(nèi)毒素"，但通常仍可檢測(cè)到微量?jī)?nèi)毒素存在。
避免倒入大塊沉淀，緩慢推動(dòng)推柄過(guò)濾。
為確保實(shí)驗(yàn)材料無(wú)內(nèi)毒素污染，建議遵循以下操作規(guī)范：首選經(jīng)認(rèn)證的無(wú)熱原/內(nèi)毒素一次性塑料耗材（市售多種品牌可。，避免使用玻璃器皿—因其表面易吸附內(nèi)毒素且常規(guī)清洗和高壓滅菌均無(wú)法有效清除（若必須使用玻璃器皿，需180℃干熱過(guò)夜處理）。特別注意曾接觸細(xì)菌的滅菌鍋會(huì)造成玻璃器皿二次污染。
可進(jìn)行內(nèi)毒素去除加強(qiáng)版的操作步驟。若Buffer ER出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于37℃加熱至完全溶解并充分混勻后使用。加入ER緩沖液后需上下顛倒以確保充分混勻。
柱平衡是通過(guò)Buffer PS預(yù)處理吸附柱，目的是激活硅基質(zhì)膜，提高其對(duì)質(zhì)粒DNA的結(jié)合效率，從而提升最終產(chǎn)物的純度和得率。
非必需，但建議添加以便監(jiān)控裂解（變藍(lán)色）和中和（無(wú)色+白色沉淀）效果。
